Influencia de las propiedades de diferentes grafeno.

Scientific Reports volumen 12, número de artículo: 13408 (2022) Citar este artículo

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Los compuestos de polímeros y nanomateriales a base de grafeno (GBN) combinan un procesamiento fácil en geometrías de membranas 3D porosas debido al polímero y estímulos de diferenciación celular debido a los rellenos de GBN. Con el objetivo de dar un paso adelante en la aplicación clínica de compuestos de polímero/GBN, este estudio realiza un análisis comparativo sistemático y detallado de la influencia de las propiedades de cuatro GBN diferentes: (i) óxido de grafeno obtenido a partir de procesos químicos de grafito (GO); (ii) óxido de grafeno reducido (rGO); (iii) grafeno multicapa producido mediante el método de exfoliación mecánica (Gmec); y (iv) grafeno poco oxidado mediante exfoliación anódica (Ganodic); dispersos en membranas porosas de policaprolactona (PCL) para inducir la diferenciación astrocítica. Las membranas planas PCL/GBN se fabricaron mediante la técnica de inversión de fases y se caracterizaron ampliamente en cuanto a morfología y topografía, estructura química, hidrofilicidad, adsorción de proteínas y propiedades eléctricas. Se realizaron ensayos celulares con células de glioma C6 de rata, como modelo para astrocitos específicos de células. Sorprendentemente, la baja carga de GBN (0,67% en peso) causó una diferencia importante en la respuesta de la diferenciación de C6 entre las membranas PCL/GBN. Las membranas PCL/rGO y PCL/GO presentaron los marcadores biomoléculas más altos para la diferenciación de astrocitos. Nuestros resultados señalaron los defectos estructurales químicos en los nanomateriales rGO y GO y los mecanismos de adsorción de proteínas como la causa más plausible que confiere propiedades distintivas a las membranas PCL/GBN para la promoción de la diferenciación astrocítica. En general, nuestro estudio comparativo sistemático proporciona conclusiones generalizables y nuevas evidencias para discernir el papel de las características de GBN para futuras investigaciones sobre membranas de fibra hueca compuestas de grafeno/PCL 3D para modelos neuronales in vitro.

La barrera hematoencefálica (BHE) es una estructura dinámica y compleja de capilares cerebrales que controlan selectivamente la homeostasis del sistema nervioso central (SNC) y lo protegen de toxinas o patógenos1,2. Desafortunadamente, muchas estrategias terapéuticas prometedoras no mostraron los resultados esperados, ya que la BHE representa un obstáculo crítico para el tratamiento de enfermedades del SNC. Así, evita que la mayoría de los fármacos terapéuticos entren en el cerebro debido a sus propiedades de barrera físicas, bioquímicas y específicas3,4.

El desarrollo de modelos neuronales in vitro constituye una fuente de conocimiento potencialmente esencial para la comprensión de enfermedades neurodegenerativas y el diseño de nuevas terapias neuroprotectoras. Pueden brindar una oportunidad para planificar nuevas plataformas de detección de fármacos, basadas en cultivos de células neuronales, para ensayos celulares dirigidos a trastornos neurológicos. La realización de modelos BBB in vitro es de suma importancia ya que ayudan a evaluar de manera confiable la eficacia de nuevos fármacos y terapias para trastornos cerebrales. El desarrollo de modelos dinámicos de BHE (DIV-BBB), que utilizan fibras huecas de polímeros comerciales como plataformas para el cultivo de células endoteliales en su superficie luminal y recrean el entorno fisiológico en términos de dinámica de fluidos, ha demostrado una reconstrucción de BBB in vitro mucho más eficiente (medida indirectamente a través de la resistencia eléctrica transendotelial (TEER)) que el método Transwell de referencia1,5. Sin embargo, los modelos DIV-BBB todavía presentan valores de TEER mucho más bajos que los tejidos nativos de BBB.

El cocultivo de células endoteliales con astrocitos se ha propuesto como un procedimiento eficiente para mejorar la reconstrucción de la BHE in vitro, ya que se ha observado el papel clave que juegan los astrocitos en el desarrollo y función del cerebro, y en la regulación del fenotipo de las células endoteliales. células en modelos BBB a través de la regulación de la comunicación entre células a través de factores solubles e interacciones directas entre astrocitos y células endoteliales6. Los trabajos en modelos DIV-BBB suelen emplear cocultivos de células endoteliales y de glioma de rata C6 inducidas a astrocitos7,8,9. Los protocolos bioquímicos para la diferenciación de C6 están de alguna manera bien estandarizados y, por lo tanto, estos trabajos suponen una diferenciación astrocítica satisfactoria. Sin embargo, las fibras huecas de polímeros comerciales utilizadas para esta aplicación (polipropileno y difluoruro de polivinilideno principalmente) presentan una pobre adhesión celular y son bioinertes. Además, en nuestro trabajo anterior10, observamos que, a pesar de utilizar protocolos estándar para inducir la diferenciación de astrocitos de células C6 sobre la superficie de fibras huecas de polímero de policaprolactona (PCL), la velocidad y la calidad de la diferenciación eran limitadas en contraste con el control positivo de cubreobjetos de vidrio.

PCL se ha utilizado ampliamente como plataforma de cultivo celular debido a su versatilidad de procesamiento (p. ej., alta solubilidad en disolventes orgánicos y bajo punto de fusión), propiedades mecánicas y la capacidad de generar estructuras tridimensionales diseñadas como matrices extracelulares dependiendo de la porosidad y la conformación. del andamio12,13. Además, el PCL procesado mediante separación inducida sin disolventes (NIPS) se ha estudiado por su potencial como andamios porosos para la reparación de tejidos duros y blandos, como vasos sanguíneos de pequeño calibre, regeneración de tejido neural y para el desarrollo de células humanas vascularizadas. tejido hepático10,14,15,16. De hecho, ha obtenido la aprobación de la Administración de Alimentos y Medicamentos (FDA) como implantes quirúrgicos y dispositivos de administración de fármacos para aplicaciones de ingeniería de tejidos y medicina regenerativa17. Para superar la diferenciación astrocítica limitada que polímeros como el PCL promueven in vitro, se han investigado numerosos enfoques que incluyen la formación de mezclas, la funcionalización de superficies y la introducción de rellenos12,13.

En los últimos años, ha aumentado con éxito el uso de nanomateriales basados ​​en grafeno (GBN) en aplicaciones biomédicas como la administración de fármacos, pruebas de diagnóstico, terapia contra el cáncer e ingeniería de tejidos18,19. Una amplia gama de nanomateriales como grafito, grafeno mono o pocas capas (FLG), óxido de grafeno reducido (rGO), óxido de grafeno (GO), nanomateriales de grafeno funcionalizados en superficie (dopados con nitrógeno, inmovilizados con proteínas, péptidos, etc.) ), y se han considerado sus derivados20. Tienen una estructura base común de una sola capa de átomos de carbono con hibridación sp2 dispuestos en una red hexagonal, pero sus propiedades químicas y físicas son diferentes dependiendo de los métodos de fabricación utilizados (exfoliación mecánica, exfoliación electroquímica, deposición química de vapor, descarga de arco, etc. .)21,22. Estudios comparativos de diferentes dispersiones de tipos de GBN (FLG, GO y rGO) en contacto con astrocitos y líneas celulares neuronales demostraron el efecto de estos nanomateriales sobre los mecanismos de diferenciación celular a través de la internalización de GBN23,24,25. Otros trabajos han estudiado la biocompatibilidad celular y la diferenciación potencial en sustratos de películas 2D a base de grafeno26,27,28,29,30. Además, algunas investigaciones se han centrado en el desarrollo de biomateriales compuestos a base de grafeno para que actúen como andamios para promover la regeneración de tejidos neuronales disfuncionales, mejorando la diferenciación neuronal y la neurogénesis20,31,32. Todos estos estudios han encontrado resultados positivos en la diferenciación de células tanto neuronales como no neuronales con GBN muy variadas como el grafeno CVD, rGO, GO y GO de pocas capas, entre otros. Sin embargo, la gran variabilidad experimental y comercial de las GBN y los resultados controvertidos sobre los mecanismos subyacentes de adhesión, proliferación y diferenciación celular siguen sin estar claros y requieren más investigación. Por ejemplo, ciertos trabajos informan claramente que GO presenta mejores respuestas de diferenciación neuronal23,33 que otros tipos de GBN como FLG o grafeno prístino, mientras que otros trabajos muestran resultados opuestos34,35. Tomando todo esto en conjunto, se justifica la necesidad de desarrollar un estudio comparativo para aclarar una pregunta clave: ¿qué propiedades debe tener cualquier GBN para inducir la diferenciación neuronal?

Como novedad, este trabajo compara la influencia de las propiedades de diferentes GBN en las mismas condiciones experimentales sobre la diferenciación astrocítica, utilizando PCL como matriz polimérica, lo que facilita la manipulación y posterior uso práctico en el desarrollo de modelos dinámicos in vitro. Para el estudio comparativo se han utilizado cuatro tipos de GBN: (i) Gmec, un grafeno multicapa producido por exfoliación mecánica; (ii) Ganodic, un grafeno poco oxidado preparado mediante exfoliación anódica; (iii) GO, producido por oxidación química del grafito y exfoliación; y (iv) rGO, producido por reducción hidrotermal de GO. El análisis se ha realizado por simplicidad en membranas compuestas planas a base de PCL/grafeno (PCL/GBN) sintetizadas por inversión de fase, que se han caracterizado para comparar el papel de los diferentes GBN en las propiedades fisicoquímicas y los mecanismos celulares implicados en la diferenciación celular. En particular, algunos estudios han sugerido que los astrocitos pueden actuar como importantes mediadores de la formación de la BHE al (i) inducir propiedades de barrera funcional en los capilares cerebrales (formación de uniones estrechas), (ii) proporcionar soporte arquitectónico para las neuronas, (iii) regular el intercambio. de moléculas que entran y salen del cerebro, (iv) controlar y modular los efectos neurotóxicos, y (v) mantener la homeostasis cerebral2,36. En consecuencia, para estudios celulares se han utilizado células cultivadas de glioma C6 de rata, ampliamente descritas como modelo experimental para la diferenciación astrocítica37,38. Para determinar el grado de diferenciación astrocítica, hemos analizado el nivel de expresión de marcadores moleculares de astrocitos específicos de cada célula. Incluyen genes que codifican la proteína ácida fibrilar glial (Gfap), una proteína de filamento intermedio clave del citoesqueleto de los astrocitos, y el transportador de glutamato-aspartato (Glast), implicado en la amortiguación del glutamato liberado sinápticamente mediante su eliminación mediante la absorción en los astrocitos39,40. Además, hemos investigado la expresión de la proteína nestina, un componente de los filamentos intermedios enriquecidos en las protuberancias de los astrocitos e implicado en la plasticidad morfológica de los astrocitos durante el desarrollo y la lesión del SNC41.

Por tanto, el objetivo principal de esta investigación es realizar un análisis sistemático y detallado del efecto de las propiedades de cuatro GBN sintetizadas mediante distintos procedimientos sobre la diferenciación astrocítica para avanzar hacia su traducción al uso clínico.

La Figura 1A muestra los espectros FTIR de nanomateriales Gmec, Ganodic, rGO y GO. El espectro GO mostró la presencia de vibración de estiramiento alcoxi C-O42 a 1047 cm-1, grupos epoxi C-O-C a 1220 cm-1 (característica del hombro)43, C-OH alcohólico a 1405 cm-1, C esquelético = C vibración de dominios grafíticos a 1622 cm-1, enlaces C=O de ácido carboxílico y grupos carbonilo a 1726 cm-1 y 2359 cm-1, respectivamente, además de una banda ancha, de 3000 a 3700 cm-1, correspondiente a el grupo hidroxilo O-H44,45. Por el contrario, en los otros GBN solo emergieron bandas débiles de enlaces C=C y C=O, lo que revela la escasez o incluso la ausencia de grupos funcionales que contienen oxígeno.

Caracterización de nanomateriales Gmec, Ganodic, rGO y GO mediante (A) FTIR y (B) espectroscopía Raman. Deconvolución de espectros XPS de picos de carbono para (C) Gmec, (D) Ganodic, (E) rGO y (F) GO. Los espectros experimentales (traza negra) se descomponen en cinco componentes: banda de carbono grafítico con un máximo de energía de enlace (BE) ~ 284,5 eV (traza gris); carbono unido individualmente a grupos epoxi e hidroxilo centrados ~ 2 eV más alto en BE que el componente anterior (azul); carbono con doble enlace en grupos carbonilo ~ 3,5 eV más alto en BE que el componente grafítico (rojo); carbono en grupos carboxilo (~ 4,5 eV más alto, verde); y \({\uppi } \to {\uppi }\)* satélite de la señal grafítica (~ 6,5 eV superior, magenta).

La Figura 1B muestra los espectros Raman de los GBN en unidades arbitrarias absolutas con tres bandas características: D, G y 2D. La banda D se atribuye a un modo de respiración de simetría A1g a 1354 cm-1, que se asocia con la presencia de sitios de trastorno sp3 o defectos estructurales como vacantes y defectos de los bordes46,47. La banda G es una dispersión de primer orden del modo E2g y surge de las vibraciones de estiramiento C=C de los carbonos unidos sp2 en planos de grafeno a 1580 cm-1. Finalmente, la banda 2D, ubicada a 2690 cm-1, es una vibración de segundo orden de la banda D causada por la dispersión de fonones en el límite de la zona del plano de grafito48. Se calculó la relación de intensidad de las bandas D y G (ID/IG)49,50. Para Gmec y Ganodic, las relaciones ID/IG fueron 0,20 ± 0,07 y 0,22 ± 0,03, respectivamente. Por el contrario, la banda D apareció con fuerza en los nanomateriales GO y rGO debido a la alta presencia de defectos, y la relación ID/IG de 0,84 ± 0,06 para GO aumentó hasta 1,01 ± 0,12 para rGO debido al proceso de reducción47,50 . Además, la relación I2D/IG aclara la transición de los enlaces de carbono con hibridación sp2 de nanomateriales cristalinos a un estado amorfo y brinda información sobre la calidad estructural de los materiales51. Las relaciones I2D/IG más altas de Gmec (0,35 ± 0,01) y Ganodic (0,36 ± 0,01) en comparación con rGO (0,05 ± 0,03) y GO (0,01 ± 0,01) ilustraron la mayor calidad estructural de estos nanomateriales. La baja relación I2D/IG de rGO y GO GBN podría estar relacionada con la rotura de la red hibridada sp2 por la introducción de grupos funcionales de oxígeno y la presencia de defectos, lo que también explica el cambio de la banda G de 1580 a 1590 cm-1. tanto en GO como en rGO51,52. Finalmente, se calculó el tamaño aparente de cristalito en el plano a lo largo del eje cristalográfico a (La)53 con valores de 96 nm, 87 nm, 19 nm y 23 nm para nanomateriales Gmec, Ganodic, rGO y GO, respectivamente. Los bajos valores de La de los nanomateriales rGO y GO podrían atribuirse a la presencia de grupos funcionales de oxígeno y al trastorno estructural relacionado (hibridación sp3, defectos de vacancia, poros, etc.) en la red de grafeno51.

Las Figuras 1C-F muestran la deconvolución de los espectros XPS de nivel central de C 1 para todos los GBN. Asimismo, la Tabla 1 recoge los diferentes tipos de enlaces entre átomos de carbono y átomos de oxígeno. En particular, las curvas desconvolucionadas de los nanomateriales Gmec (Fig. 1C), Ganodic (Fig. 1D) y rGO (Fig. 1E) revelaron el grado limitado de oxidación de estos GBN, con un gran porcentaje atómico de C grafítico y un alto nivel. de conjugación electrónica (\({\uppi } \to {\uppi }\)* banda satelital) en estas muestras (Tabla 1). En rGO, algunos grupos epoxi e hidroxilo todavía estaban en el nanomaterial después del proceso de reducción. En particular, la baja presencia de dominios aromáticos en GO (Fig. 1F) se refleja en la baja intensidad del satélite \({\uppi } \to {\uppi }\)* asociado a su señal grafítica (Tabla 1). Los espectros de estudio XPS (Fig. S1) confirmaron la presencia de C y O en GBN, con niveles centrales de C 1 s y O 1 s a 284,5 eV y ~ 532 eV, respectivamente54. La Tabla S1 muestra la composición elemental de los GBN con un porcentaje atómico de oxígeno de GO (29,4%)> rGO (10,8%)> Gmec (3,6%)> Ganódico (3,0%). Observamos que, aunque en principio el contenido de oxígeno también podría evaluarse a partir de los datos recopilados en la Tabla 1 haciendo algunas suposiciones sobre el tipo de enlace (por ejemplo, epoxi o hidroxilo), la asimetría intrínseca de la banda de carbono grafítico normalmente conduciría a una sobreestimación del porcentaje atómico de oxígeno. De hecho, incluso cuando las bandas de grafito están equipadas con una función asimétrica, como en el presente trabajo (ver “Síntesis y caracterización de nanomateriales basados ​​en grafeno” para más detalles), parte de la intensidad que realmente proviene de la cola de la señal de grafito se asigna erróneamente. a grupos que contienen oxígeno. Sin embargo, aunque el contenido de oxígeno se determina con mayor precisión a partir de los espectros de estudio (Tabla S1), los datos de deconvolución siguen siendo útiles para una comparación semicuantitativa entre los diferentes materiales (Tabla 1).

En resumen, los defectos del grafeno están relacionados en general con el carbono sp3 presente en los límites de los granos, grupos oxigenados o vacantes de unión del grafito. Gmec y Ganodic tienen una alta tasa de carbono grafítico y un bajo contenido de oxígeno, por lo que la baja cantidad de defectos que presentan estos GBN podría atribuirse principalmente a defectos en los límites de grano. GO tiene un gran porcentaje de grupos oxígeno, lo que explica el bajo carbono grafítico presente en este material. Mientras tanto, rGO ha recuperado parcialmente el contenido de carbono grafítico y presenta una reducción en el contenido de oxígeno en comparación con GO, pero los datos Raman apuntan a un grado similar de defectos estructurales que GO. Esto podría explicarse por la presencia de vacantes de unión de grafito en rGO que normalmente se logran durante el proceso de reducción de GO.

Las Figuras 2A – E y F – J muestran imágenes SEM de membranas PCL / GBN de la superficie superior y la morfología de la sección transversal, respectivamente, que exhiben una morfología diferente según el GBN incorporado. La Tabla 2 recopila el espesor, la porosidad aparente, la porosidad superficial y el tamaño promedio de los poros superficiales y el tamaño de los poros de la sección transversal de las membranas.

(A – E) Imágenes SEM de superficie superior y (F – J) de sección transversal de las membranas PCL y PCL/GBN. Barra de escala de 30 µm.

Las membranas PCL/GBN muestran un espesor y una porosidad aparente similares sin diferencias estadísticas significativas en comparación con PCL (Tabla 2). Todas las membranas exhibieron una estructura interna similar a una esponja con microporos celulares cerrados, característica de las membranas poliméricas de fases separadas55. Además, presentaron una alta porosidad aparente (~ 70%) e interconectividad entre los poros que potencialmente pueden proporcionar propiedades favorables de transporte de nutrientes, beneficiar la transferencia molecular y podrían ser adecuados para la adhesión y proliferación celular. La porosidad de la superficie (Fig. 2A-E) se mantuvo similar cuando se introdujeron GBN, excepto para las membranas PCL/Gmec que se redujo de 31,3 ± 2,2% para PCL a 24,7 ± 1,7%. Se observó un comportamiento similar para el tamaño promedio de poro superficial. Es de destacar que el tamaño promedio de los poros de la sección transversal de las membranas PCL/GO fue significativamente mayor que el de las membranas PCL (Tabla 2). Esto podría estar asociado con la alta relación atómica O/C de 0,44 en GO, de modo que este último podría atraer moléculas del coagulante IPA mediante la formación de enlaces de hidrógeno, acelerando así la separación de fases.

Las Figuras 3A-D representan los espectros Raman y las imágenes ópticas de las membranas superficiales de PCL/GBN para evaluar la dispersión de los GBN. Las diferentes relaciones IG/ICH2 significaron una distribución diferente de GBN en toda la superficie de la membrana con un grado de homogeneidad en la dispersión de la siguiente manera: PCL/GO > PCL/Ganodic > PCL/rGO > PCL/Gmec. En particular, en las membranas PCL/Gmec (Fig. 3A) hubo áreas donde no se detectó Gmec. Por el contrario, el resto de membranas PCL/GBN presentaron concentración de GBN en cualquier punto medido en la superficie. También es notable la baja intensidad absoluta del espectro Raman de las membranas PCL/Ganódica (Fig. 3B) y la presencia de bandas de alta intensidad correspondientes a GO en toda la superficie de PCL/GO (Fig. 3D). La espectroscopia Raman y FTIR en las figuras S2A, B, respectivamente, confirman la presencia de bandas características de GBN en las membranas de PCL.

Caracterización fisicoquímica y propiedades eléctricas de membranas PCL y PCL/GBN. Espectros Raman e imágenes ópticas de un mapeo de superficie de 100 × 100 µm para membranas (A) PCL/Gmec, (B) PCL/Ganodic, (C) PCL/rGO y (D) PCL/GO. La dispersión de GBN se muestra mediante cálculos de la relación IG/ICH2 en cada punto discreto. Los puntos (1) y (2) exhiben un contenido menor y mayor de GBN, respectivamente, y ○ representa la zona de análisis mediante el láser Raman-Confocal. (E) Conductividad eléctrica y (F) propiedades de permitividad dieléctrica. Significación estadística respecto al PCL (*p < 0,05; **p < 0,01).

La conductividad eléctrica y la permitividad dieléctrica, Fig. 3E, F, respectivamente, se evaluaron mediante mediciones de impedancia a 1184 Hz, 53,915 Hz y 105,780 Hz. Hay que considerar que en condiciones fisiológicas en estudios con animales56, se requieren frecuencias de al menos 1000 Hz para inducir la conducción eléctrica a través de los axones neurales. En general, todas las membranas exhibieron el comportamiento típico informado para aisladores eléctricos con una conductividad eléctrica aumentando (Fig. 3E) y la permitividad dieléctrica disminuyendo (Fig. 3F) con la frecuencia. La baja conductividad eléctrica de las membranas de PCL fue comparable al valor informado en otros lugares57,58, lo que confirma el comportamiento aislante de este polímero. Específicamente, las conductividades eléctricas encontradas para las membranas PCL (5,5·10–4 S m−1) y PCL/rGO (7,1·10–4 S m−1) fueron similares a los valores reportados previamente por Sánchez-González et al.59 (9,9·10–4 S m−1 y 1,8·10–3 S m−1 para membranas PCL y PCL/rGO, respectivamente). Por lo tanto, no hubo mejoras significativas en las propiedades eléctricas en masa cuando se introdujeron GBN en la matriz polimérica, ya que la concentración del 0,1% en peso de nanopartículas cargadas fue insuficiente para alcanzar el umbral de percolación eléctrica13,48. Sin embargo, es digno de mención una disminución significativa en las propiedades de conductividad eléctrica de las membranas PCL/Gmec y PCL/GO en comparación con PCL.

La rugosidad de la superficie de las membranas PCL y PCL/GBN (Fig. 4A-E) aumentó en el orden: PCL/Gmec

Caracterización topográfica y de adsorción de proteínas de membranas PCL y PCL/GBN. Imágenes 3D de áreas de escaneo de 40 × 40 μm y valores de rugosidad de la superficie mediante AFM para membranas (A) PCL, (B) PCL/Gmec, (C) PCL/Ganodic, (D) PCL/rGO y (E) PCL/GO. . (F) Mediciones de WCA en superficies de membrana. (G) Adsorción total de proteína modelo BSA y DMEM + medio de cultivo celular FBS al 10% en membranas planas. Significación estadística respecto al PCL (*p < 0,05; **p < 0,01).

Se examinó la adsorción de la proteína modelo BSA individual y DMEM + 10% de la mezcla de FBS en las diferentes membranas (Fig. 4G). Las membranas PCL/Ganódica presentaron la mayor adsorción de proteínas (51 ± 2 µg·cm-2 para BSA y 92 ± 7 µg·cm-2 para DMEM + 10% FBS) seguidas de PCL/Gmec y PCL/rGO, y significativamente mayor que Membranas PCL. Por otro lado, las membranas PCL/GO presentaron la menor adsorción de proteínas entre todas las membranas PCL/GBN. La capacidad de adsorción de proteínas en las membranas PCL/Gmec, PCL/Ganodic y PCL/rGO se puede atribuir a un proceso de fisisorción controlado por interacciones π-π y fuerzas hidrofóbicas60. En las membranas PCL/GO la alta presencia de grupos oxígeno contribuye a la adsorción de proteínas61,62. No obstante, las imágenes SEM de la superficie de las membranas (Fig. 2A-E) evidenciaron una morfología de superficie porosa en las membranas PCL / GO (Fig. 2E) con un área de adsorción efectiva potencialmente menor que el resto de las membranas. Esto podría producir un artefacto en la normalización de la masa de proteína adsorbida por la superficie de la membrana y explicar los resultados anormalmente bajos de adsorción de proteínas obtenidos para las membranas PCL/GO.

La morfología de las células C6 y la diferenciación hacia astrocitos se analizaron en membranas PCL y PCL/GBN (Fig. 5). La Figura 5A-E muestra células C6 teñidas con faloidina conjugada con FITC para actina F de microfilamentos. Después de 5 días de diferenciación, las células C6 exhibieron la reducción característica de la señal del citoesqueleto de actina fluorescente en todas las membranas planas. Específicamente, la Fig. 5D, E mostró una morfología en forma de huso en células C6 con la formación de proyecciones citoplasmáticas largas y delgadas. De manera similar, se cultivaron células C6 en cubreobjetos de vidrio como controles positivos de la diferenciación astrocítica (Fig. S3). Mostraron cambios morfológicos dramáticos desde una forma poligonal plana y un citoesqueleto de actina bien definido, incluidas las fibras de estrés características de la etapa de adhesión en el día 0 de diferenciación (Fig. S3A, B), hasta una morfología preferencial en forma de huso con extensiones celulares largas y delgadas. en el día 5 de diferenciación astrocítica (Fig. S3C, D). El porcentaje de diferenciación de células C6 se presenta en la Fig. 5F. Se obtuvo un valor de 54,2 ± 3,4% para los controles positivos mientras que para las membranas disminuyó en el siguiente orden: PCL/GO (26,3 ± 5,5%) > PCL/rGO (22,3 ± 2,7%) > PCL/Ganodic (9,1 ± 0,7%) > PCL/Gmec (8,8 ± 2,7%) > PCL (4,7 ± 2,7%). Específicamente, las membranas PCL, PCL/Gmec y PCL/Ganodic produjeron una morfología de células redondas (Fig. 5A-C) y el 60-75% del total de células mostraron solo una proyección celular (Fig. 5G). Sorprendentemente, las células C6 cultivadas en PCL/Gmec (Fig. 5B) formaron grupos de células que se asemejaban a estructuras multicelulares similares a esferoides, como se informó anteriormente63. Por el contrario, las membranas PCL/rGO y PCL/GO estimularon sustancialmente la formación de dos a cinco extensiones celulares, asemejándose a la morfología estrellada típica de los astrocitos (Fig. 5D, E, G). Tanto las membranas PCL/rGO como PCL/GO promovieron un marcado cambio en la forma celular a una forma asimétrica con procesos alargados. Alrededor del 22% y el 31% de las células C6 exhibieron más de dos proyecciones en las membranas PCL/rGO y PCL/GO, respectivamente, una proporción significativamente mayor que la estimada en las células C6 cultivadas en cubreobjetos de vidrio (controles positivos), donde solo el 3% de Las células tenían más de dos proyecciones celulares.

Análisis morfológico de la diferenciación de células C6 hacia astrocitos teñidos con Phalloidin-FITC en (A) PCL, (B) PCL/Gmec, (C) PCL/Ganodic, (D) PCL/rGO y (E) PCL/GO membranas planas mediante imágenes confocales. Barra de escala = 30 µm. Cuantificación de (F) células diferenciadas C6 después de 5 días de tratamiento con dbcAMP, y (G) número de proyecciones por célula en controles positivos y membranas planas. (H) Expresiones de ARNm normalizadas de los genes Gfap y Glast evaluadas mediante PCR cuantitativa en tiempo real, y (I) expresión de la proteína nestina cuantificada mediante transferencia Western que muestra la diferenciación de células C6. Todas las imágenes de transferencia Western se presentan en la Fig. S4. Significación estadística respecto al PCL (**p < 0,01; n ≥ 4).

Además, se analizaron los cambios en la expresión de genes que codifican dos proteínas clave, Gfap y Glast, para la diferenciación de las células C6 hacia astrocitos. El análisis RT-qPCR de la expresión de Gfap en células C6 cultivadas en las membranas estudiadas mostró los siguientes niveles relativos de ARNm: PCL/Ganodic (2,60 ± 0,16) > PCL/GO (2,37 ± 0,15) > PCL/rGO (2,33 ± 0,16) > PCL /Gmec (1,34 ± 0,13). Curiosamente, los niveles de expresión en las membranas PCL/Ganodic, PCL/GO y PCL/rGO fueron significativamente mayores en comparación con el nivel en las membranas PCL normalizadas a 1 (Fig. 5H). Con respecto a la expresión de Slc1a3 (Glast), solo las células C6 cultivadas en membranas PCL/rGO (1,66 ± 0,31) y PCL/GO (2,97 ± 0,06) mostraron niveles significativamente mayores en comparación con las células C6 cultivadas en membranas PCL (Fig. 5H). Finalmente, la Fig. 5I presenta la transferencia Western de lisados ​​celulares, que revela un aumento relativo de 1,6 veces en la expresión de la proteína nestina en células C6 cultivadas en membranas PCL/rGO y PCL/GO en comparación con PCL.

Diferentes características de GBN pueden influir en las propiedades de la membrana PCL/GBN e inducir distintas respuestas celulares e interacciones entre células y material. Nuestros resultados indican que la introducción de una concentración teórica de 0,67% en peso de nanomateriales rGO y GO en la matriz polimérica de PCL aumentó significativamente el porcentaje de células C6 diferenciadas, así como el número de sus extensiones celulares, en comparación con PCL y otros PCL/ Membranas GBN. Además, los ARNm de Gfap y slc1a3 (Glast) y las expresiones de la proteína nestina aumentaron tanto en las membranas PCL/rGO como en PCL/GO. Específicamente, Gfap es una proteína de filamento intermedio de astrocitos que desempeña un papel clave tanto en la determinación de la forma celular como en el mantenimiento del soporte estructural para la red astrocítica espacial del SNC. En particular, los astrocitos perivasculares son esenciales para el establecimiento de la BHE, incluidas las propiedades de barrera de las células endoteliales (uniones estrechas) y el transporte selectivo dentro y fuera del cerebro de agua y diferentes solutos de la BHE41,64. Por lo tanto, la expresión de Gfap es necesaria para una diferenciación exitosa de las células C6 hacia astrocitos. El aumento de la expresión de Gfap en membranas PCL/Ganodic, PCL/GO y PCL/rGO en más de 2,3 veces fue comparable a los resultados obtenidos en la literatura para andamios 3D65,66,67. En este contexto, Song et al.65 demostraron que la incorporación de 0,1% en peso de GO en nanofibras PCL/GO aumentaba 1,7 veces la expresión de Gfap en células de feocromocitoma de rata similares a neuronas (línea PC12), mientras que las células madre neurales (NSC) ) se diferenciaron favorablemente en astrocitos en microfibras rGO o espumas de grafeno, mejorando la expresión de Gfap 1,43 veces y 2,5 veces, respectivamente66,67. Además, las propiedades amortiguadoras de los astrocitos transportadores de glutamato, como Glast, mantienen los niveles cerebrales extracelulares de glutamato en bajas concentraciones, ya que su acumulación en el espacio sináptico produce sobreestimulación neuronal y excitotoxicidad, y ha estado implicado en varias enfermedades neurodegenerativas64,68. Varios trabajos informaron la localización de Glast en la membrana celular y extensiones celulares en astrocitos de cerebro de rata cultivados36,64,68. Curiosamente, algunos autores identificaron una superposición funcional entre Gfap y Glast69,70. Chiacchiaretta et al.23 describieron que los astrocitos interactúan activamente con diferentes GBN promoviendo su estelación y aumentando la inmunorreactividad de Gfap y la captación de glutamato, mientras que Sullivan et al.70 propusieron que la proteína Gfap permite la retención del transportador Glast a través de proteínas de enlace intermedio en la membrana plasmática para Favorece la homeostasis del glutamato. En este sentido, aunque las membranas PCL/ganódicas mostraron una alta capacidad para activar la expresión de Gfap en las células (Fig. 5H), la participación conjunta de Gfap y Glast puede ser crucial para promover la reorganización del citoesqueleto, el crecimiento de extensiones celulares y la captación de glutamato durante la diferenciación astrocítica. .

Finalmente, la nestina es uno de los filamentos intermedios expresados ​​en las primeras etapas del desarrollo del cerebro y se encuentra en las protuberancias celulares, así como en las puntas en crecimiento de las extensiones de las células astrogliales. Nestin puede formar filamentos heteropoliméricos con vimentina o Gfap como socios obligatorios. De hecho, se ha afirmado que Gfap controla la dinámica de la red nestin41,64. En este sentido, al igual que ocurrió en nuestro trabajo, Guo et al.66 también informaron la presencia de células nestina positivas en microfibras rGO después de 3 días de cultivo de NSC.

Es importante abordar las posibles interacciones célula-material relacionadas con las caracterizaciones de sustrato realizadas que podrían explicar la promoción y modulación de la diferenciación de las células C6 hacia astrocitos gracias a la adición de GBN. La Figura 6 presenta las propiedades fisicoquímicas factibles de los GBN que potencialmente afectan los procesos de diferenciación celular: (i) interacciones biomoleculares, (ii) propiedades eléctricas y (iii) topografía y rigidez local.

Los mecanismos subyacentes detrás de la modulación de la diferenciación celular debido a la presencia de GBN: (A) interacciones biomoleculares, (B) propiedades eléctricas y (C) topografía de la superficie e influencia de la rigidez local [adaptado de Luong-Van et al.52].

Las interacciones biomoleculares (Fig. 6A) representan la capacidad de los GBN para unirse a proteínas, factores de crecimiento y biomoléculas a través de diferentes interacciones químicas como enlaces de hidrógeno, fuerzas electrostáticas, interacciones hidrofóbicas y \({\uppi } - {\uppi }\ ) bonos. Estas interacciones podrían aumentar su biodisponibilidad local, promoviendo fuertes interacciones entre el material celular e induciendo diferentes respuestas celulares27,52. Esta hipótesis podría confirmarse porque después de 1 día de cultivo celular, observamos que los GBN mejoraron mucho la unión y proliferación de las células C6, lo que podría estar relacionado con la mejora de la adsorción de proteínas del medio de cultivo (Fig. 4G). Por lo tanto, en las membranas GBN, la adsorción de proteínas fue promovida por interacciones hidrofóbicas y \({\uppi } - {\uppi }\) asociadas con los dominios extendidos conjugados electrónicamente (aromáticos) presentes en Gmec, Ganodic y rGO, como lo revela XPS (Tabla 1). Por el contrario, dichos dominios eran menos abundantes en GO, lo que apunta a niveles de adsorción de proteínas comparables a los de PCL. Además, la morfología de la superficie de PCL/membrana ganódica (Fig. 2C) presentó cavidades que pueden actuar como reservorios moleculares, lo que lleva a una superficie específica efectiva más alta que en una superficie plana y, por lo tanto, a una mayor adsorción de proteínas. Para la proteína BSA, la fuerte interacción con biomateriales hidrófobos se atribuyó anteriormente a la unión intermolecular proteína-sustrato a través de parches hidrófobos y cadenas de aminoácidos27,28,32. Además, la adsorción de BSA significativamente menor en las membranas PCL/rGO y PCL/GO se justificó por la presencia de repulsiones electrostáticas entre la proteína cargada negativamente a pH 7,471 y los grupos de oxígeno confirmados por un contenido de oxígeno de 10,8 at% y 29,5 at%. para rGO y GO, respectivamente (Tabla S1). Presumiblemente, esta repulsión electrostática redujo la adsorción de BSA en las superficies de las membranas PCL/rGO y PCL/GO y puede producir una mayor adsorción de otras proteínas como la fibronectina, laminina o vitronectina, que son tres componentes de la matriz celular y los medios de cultivo, jugando un papel importante en la unión celular al sustrato, la modulación del comportamiento de las NSC y el crecimiento y la migración neuronal61,72. Sorprendentemente, la proteína laminina interactúa y controla las proteínas de membrana, como el receptor de laminina B, mejorando el enlace de la matriz extracelular de la membrana celular con la cromatina y promoviendo la diferenciación celular73,74. En concreto, se demostró que las lamininas actúan como factores haptotácticos in vitro, es decir, induciendo la migración de los astrocitos y favoreciendo su diferenciación75. Por lo tanto, la menor adsorción de la proteína globular BSA en PCL/rGO y PCL/GO puede mejorar la adsorción de la proteína laminina y, lo que es más importante, la promoción de un enlace directo entre los receptores celulares con la superficie de la membrana, lo que desencadena la diferenciación celular.

Centrándonos en la humectabilidad, el carácter hidrofílico de los sustratos superficiales puede conducir a un mayor anclaje celular al mejorar el grado de contacto entre los receptores celulares y el entorno fisiológico76. Las membranas PCL/GO fueron ligeramente hidrófilas con un WCA de 87 ± 5°, mientras que las otras membranas fueron más hidrófobas, con valores promedio superiores a 90°. La interacción entre la gota de agua y la superficie de las membranas PCL/GO disminuyó la WCA de estas membranas debido a la presencia de grupos que contienen oxígeno. Además, sus interacciones electrostáticas podrían mejorar los enlaces fisicoquímicos entre células y superficies como ocurrió en otros trabajos28,77.

Otro punto crítico es la existencia de defectos estructurales y químicos en las GBN en forma de sitios altamente reactivos o "puntos calientes" para las interacciones entre proteínas y material celular28,52,61. La oxidación química y exfoliación del grafito para la producción de GO, y luego su reducción hidrotermal para obtener rGO, produjeron defectos estructurales y químicos que alteraron la hibridación del carbono sp2 y distorsionaron la estructura del anillo de benceno, con valores promedio de 0,84 y 1,01 para las relaciones ID/IG. respectivamente. Por el contrario, los nanomateriales Gmec y Ganodic presentaron menos defectos, como era de esperarse debido a su método de síntesis. Además, los valores más bajos de I2D/IG obtenidos previamente para nanomateriales rGO y GO respaldan la evidencia de la mayor cantidad de desorden estructural para estos nanomateriales, ya que la banda 2D tiende a disminuir en presencia de grandes cantidades de desorden50. La alta presencia de defectos de vacancia y borde, y el desorden estructural en rGO y GO GBN podrían proporcionar sitios altamente reactivos y mayores profundidades de indentación para mejorar no solo la adsorción de proteínas sino también las interacciones y el anclaje del material celular, que probablemente influyen en los procesos de diferenciación celular. Por lo tanto, la presencia de defectos en las GBN probablemente proporciona un contacto directo entre los receptores de la membrana celular y la superficie de la membrana, lo que desencadena cascadas intracelulares que modularían la respuesta de diferenciación y potencialmente influirían en el destino celular.

El segundo mecanismo implica el papel crítico de las propiedades eléctricas en los tejidos neurales y la diferenciación celular donde la comunicación celular depende en gran medida de señales eléctricas, como se representa en la Fig. 6B. Varios trabajos informaron que los ambientes eléctricamente conductores podrían modular localmente la actividad biológica y conducir a una mejor diferenciación celular, como el crecimiento y la germinación de neuritas20,52,76. De esta manera, Sánchez-González et al.59 sugirieron que la mayor actividad neuronal de las células progenitoras neurales maduras cultivadas en membranas PCL/rGO podría atribuirse a sus mayores propiedades eléctricas en comparación con las membranas PCL y PCL/GO. Por tanto, se evaluó el carácter electroconductor de los andamios. Todas las membranas exhibieron un comportamiento aislante (Fig. 3E, F), aunque se observó una pequeña reducción de las propiedades eléctricas en las PCL/Gmec y PCL/GO. Para PCL/Gmec, se atribuyó a la naturaleza mecánicamente exfoliada de Gmec y a la formación de grandes agregados de nanoplaquetas con vías no conductoras (Fig. 3A), lo que obstaculizó las redes de transporte de carga como ya propusieron Xia et al.78 para el grafeno. nanocompuestos poliméricos. Para las membranas PCL/GO, los poros grandes que se encuentran en la sección transversal (Fig. 2J) podrían producir una alta resistividad como resultado de las mayores distancias entre las nanopartículas conductoras79. Además, el nanomaterial GO es conocido como un mal conductor65 y presentó un 29,4% de oxígeno atribuido a grupos oxigenados (Tabla S1) que alteran la estructura de carbono extendida con hibridación sp2. En general, no pudimos encontrar evidencia de que las propiedades eléctricas contribuyeran a la respuesta de diferenciación celular.

Finalmente, se ha demostrado previamente que la topografía y la rigidez de la superficie juegan un papel fundamental en el contacto entre la membrana celular y los sustratos (Fig. 6C). Estas señales biofísicas pueden promover diferentes anclajes celulares y vías mecanosensibles, que producen un reordenamiento del citoesqueleto celular y desencadenan una cascada de señales de transducción que modulan la diferenciación celular28,52. Aunque Lee et al.80 observaron que los nanopatrones en las películas rGO y GO afectaban el crecimiento de neuritas, nuestras membranas PCL/GBN exhibieron una rugosidad superficial similar a nivel microscópico sin significación estadística. Debido a la topografía a nivel micro de las membranas, el análisis de la rigidez mecánica de la superficie basado en AFM estaba fuera del rango de sensibilidad del equipo utilizado en este estudio, y otras técnicas de indentación macroscópica también tuvieron que descartarse porque dañaban el polímero. material. Por otro lado, la rigidez local influye fuertemente en el destino celular iniciando cascadas de mecanotransducción y diferenciación celular, y podría verse afectada por la agregación/aglomeración de nanopartículas de GBN y la presencia de defectos estructurales químicos52,81. La dispersión homogénea de GBN en matrices de membrana refuerza sus propiedades mecánicas81. Tanto PCL/Gmec (Fig. 3A) como PCL/rGO (Fig. 3C) presentaron aglomerados en la superficie de la membrana, mientras que la rGO estuvo presente en toda la superficie de PCL/rGO, en las membranas de PCL/Gmec hubo regiones donde solo se detectó PCL. . Para PCL/Ganodic (Fig. 3B) y PCL/GO (Fig. 3D), las nanopartículas a base de grafeno estaban bien dispersadas. Además, la incorporación de GBN defectuosas con rGO y GO en la matriz polimérica de PCL creó topografías en el orden de la nanoescala que, cuando se combinan con la presencia de defectos de borde o vacantes, pueden producir estrés mecánico a nivel celular promoviendo la diferenciación52. Sin embargo, las membranas de PCL/GBN contenían sólo 0,67% en peso de GBN en la membrana sólida y, por lo tanto, no se espera que la rigidez mecánica en la superficie de la membrana cambie sustancialmente a nivel de volumen.

En este estudio, se fabricaron membranas planas a base de PCL/grafeno mediante una técnica de inversión de fase para dilucidar si existen características óptimas de los nanomateriales a base de grafeno (GBN) que se dispersarán en la matriz polimérica de PCL para inducir la diferenciación astrocítica. Se cargó en las membranas de PCL una concentración del 0,67% en peso de los diferentes GBN sintetizados por distintos métodos (Gmec, Ganodic, rGO y GO). Se evaluaron las propiedades fisicoquímicas, eléctricas y topográficas de los andamios compuestos, así como la capacidad de adsorción de proteínas y la funcionalidad biológica. En general, el cambio característico en las células C6 hacia una morfología astrocítica diferenciada, junto con las altas expresiones de los genes Gfap y Glast, y la presencia de células nestina positivas, reveló que tanto las membranas PCL/rGO como PCL/GO actuaron como los sustratos más favorables. para mejorar la diferenciación astrocítica. Estos resultados podrían justificarse por: (i) la presencia de defectos estructurales químicos en los nanomateriales rGO y GO, y (ii) la capacidad de adsorción selectiva de proteínas (es decir, laminina sobre BSA) de las membranas PCL/rGO y PCL/GO. Ambos mecanismos favorecieron la interacción de los receptores de la membrana celular con las biomoléculas adsorbidas sobre los sustratos PCL/rGO y PCL/GO, y el contacto directo con estas superficies planas de la membrana. Los resultados confirmaron que la diferenciación astrocítica está modulada por la presencia de defectos, por lo que los GBN con estas características deben seleccionarse sobre los cristalinos. Además, la dispersión uniforme de los nanomateriales GO y rGO a lo largo de la superficie de la membrana favoreció el anclaje celular a puntos accesibles y estratégicos de la membrana celular a estas superficies PCL/GBN, y el crecimiento y brote de extensiones celulares. Es de destacar que estos sustratos biocompatibles tienen el potencial de inducir la diferenciación astrocítica incorporando solo 0,67% en peso de GBN en la matriz polimérica, sin aumentar sustancialmente el costo de las membranas y reduciendo la posible controversia con los efectos citotóxicos.

Como novedad importante, este trabajo comparó sistemáticamente la influencia de las propiedades de cuatro GBN diferentes en la diferenciación astrocítica en condiciones experimentales iguales y dispersos en la misma plataforma de matriz polimérica PCL, lo que permite sacar conclusiones generalizables para futuras investigaciones hacia la traducción clínica de estos materiales compuestos. .

En este trabajo se utilizaron diferentes calidades de GBNs: nanoplaquetas de grafeno/grafito exfoliadas mecánicamente (Gmec, Av-PLAT-7, adquiridas de Avanzare Innovación Tecnológica); grafeno con oxidación mínima producida por exfoliación anódica acuosa de grafito con Na2SO4 como electrolito principal y NaCl como coelectrolito, como hemos informado anteriormente49 (Ganodic); nanohojas de óxido de grafeno dispersadas en agua destilada a 4 mg·mL-1 (GO, Graphenea, SA); y rGO obtenido mediante un método de reducción hidrotermal82 del GO comercial (Graphenea).

Los nanomateriales a base de grafeno se caracterizaron mediante espectroscopia fotoelectrónica de rayos X (XPS), infrarroja por transformada de Fourier (FTIR), Raman y. Los espectros FTIR se obtuvieron utilizando un espectrofotómetro (espectrómetro Spectrum 65 Two, PerkinElmer, España) y operando en el modo de reflectancia total atenuada (GladiATR, PIKE Technologies, EE. UU.). Los espectros Raman se adquirieron con un instrumento Confocal-Raman NRS-4500 (Jasco, España). Se enfocó una longitud de onda de excitación de 532 nm con un objetivo 50 × MPlan FLN 0,8 NA a una potencia láser efectiva de 4,4 mW. Los datos se recogieron utilizando el software Spectra Manager™. XPS se llevó a cabo en un sistema SPECS bajo una presión de 10–7 Pa utilizando una fuente de rayos X no monocromática Al Kα (14 kV a 175 W). Se preparó un sedimento de cada polvo de GBN para las mediciones. Los datos XPS se analizaron utilizando el software CasaXPS. Para la deconvolución de los espectros de alta resolución de C 1 s, las bandas se ajustaron como una convolución (simétrica) de una función gaussiana y lorentziana (80:20), mientras que la banda grafítica se equipó con la misma convolución modificada por una función para aproximar su forma asimétrica, específicamente, la forma asimétrica debida a Ulrik Gelius implementada en el software CasaXPS. Tanto los datos Raman como XPS fueron procesados ​​posteriormente por el software Origin Pro 2017.

Se prepararon membranas planas a base de PCL/grafeno mediante inversión de fases adaptando el procedimiento descrito en otro lugar82. La concentración de nanomaterial se seleccionó en base a resultados previos que confirmaron que las membranas preparadas a partir de soluciones con una carga de GBN superior al 0,1% en peso eran difíciles de manipular y mecánicamente inestables83. Además, el uso de una baja cantidad de GBN en la matriz polimérica es intrínsecamente un beneficio de esta tecnología ya que, por un lado, minimiza la posible exposición citotóxica de las células a los nanomateriales de grafeno en caso de que se lixiven de la matriz de PCL, y por otro lado, por otro lado se reducen los costes de producción asociados al grafeno. Por lo tanto, se dispersó homogéneamente 0,1% p/p de GBN mediante ultrasonicación en el disolvente N-metil-2-pirrolidona (NMP, 99% extrapuro, Acros Organics). Los diferentes tiempos de ultrasonicación para lograr soluciones líquidas de grafeno estables durante 24 h fueron 40 min para los nanomateriales Gmec y GO, 70 min para Ganodic previamente exfoliado y 90 min para rGO. Posteriormente, se añadió 15% p/p de polímero PCL (PM, 80 kDa, Sigma Aldrich) a las dispersiones de GBN/NMP y se agitó durante 48 h a 37 °C hasta lograr una solución uniforme. Las soluciones poliméricas se moldearon sobre una placa de vidrio usando un espesor de 200 µm para la cuchilla de moldeo (Elcometer 3580/2, EE. UU.), se sumergieron en un baño de coagulación de 2-propanol al 100% v/v (IPA, 99%, Oppac), y Lavado con agua ultrapura para eliminar restos de disolvente. Finalmente, las membranas sintetizadas contenían una concentración teórica de 0,67% en peso de GBN. A modo de comparación, también se prepararon membranas de control que contenían sólo PCL (15% p/p de PCL en NMP).

La morfología y estructura de la sección transversal y la superficie de las membranas planas PCL/GBN se determinaron mediante microscopía electrónica de barrido (SEM, EVO MA 15, Carl Zeiss, Alemania) a un voltaje de 15 kV. Para las imágenes de secciones transversales, las muestras de membrana se congelaron en nitrógeno líquido y se fracturaron. Todas las muestras se mantuvieron durante la noche a 30 °C al vacío (200 mbar) y se pulverizaron con oro antes del examen. Para estudiar la porosidad de la superficie (n ≥ 3) y el tamaño promedio de los poros (n ≥ 100), se utilizó el software ImageJ. Para determinar el espesor (δ) de los armazones de PCL/GBN, se midieron muestras de membrana (n ≥ 8) utilizando un micrómetro electrónico (Serie 293, Mitutoyo, España). Además, la porosidad aparente (\(\varepsilon\)) se midió utilizando un sistema de pesaje hidrostático MS-TS (Mettler Toledo, España) y se calculó según la ecuación. (1), donde \({\uprho }_{{\text{m}}}\) es la densidad medida de las membranas (n ≥ 3) y \({\uprho }_{{\text{t} }}\) es la densidad teórica del polímero PCL.

Las propiedades eléctricas de las membranas PCL/GBN se evaluaron mediante espectroscopia de impedancia con una estación de trabajo electroquímica (Zennium, Zahner, Alemania) utilizando un método de contacto directo. Las muestras de membrana seca (n \(\ge\) 3) con un área específica de 1,3 cm2 se colocaron entre los electrodos en un soporte externo. Todas las mediciones de impedancia se realizaron a temperatura ambiente en modo potenciostático y la frecuencia varió en el rango de 1 a 600 kHz.

La topografía de la superficie se analizó mediante microscopía de fuerza atómica (AFM, NTegra NT-MDT, Rusia) en modo semicontacto utilizando una sonda de silicio NSG-03 y voladizos de silicio dorado con frecuencias de resonancia de 47 a 150 kHz y se caracterizó por el parámetro de rugosidad de la superficie cuadrática media. (Cuadrados). Además, se evaluó la humectabilidad de la superficie de la membrana (n \(\ge\) 11) con agua ultrapura según un método de gotas sésiles mediante un analizador de forma de gota (DSA25, KRÜSS Scientific, Alemania). En la evaluación de la adsorción de proteínas, se expusieron 2,5 cm2 de membranas PCL/GBN a dos soluciones: 10% de suero fetal bovino (FBS, Gibco™) en medio Eagle modificado por Dulbecco (DMEM, Gibco™) y 4 g·L-. 1 de albúmina sérica bovina (BSA, A9647, p ≥ 98%, Sigma Aldrich) en solución tampón fosfato (PBS, pH 7,4). Después de 24 h de incubación a 37ºC y 5% de CO2, las muestras de membrana se enjuagaron dos veces con PBS y las proteínas adsorbidas se eliminaron con 1% de dodecilsulfato de sodio (SDS). La proteína total se cuantificó siguiendo el protocolo del kit de ensayo de proteínas del ácido bicinconínico (BCA, Pierce™) y utilizando un lector de microplacas Spark® (Tecan, Suiza). También se registraron espectros FTIR y Raman en membranas PCL/GBN.

Se pegaron muestras de membrana de 14 mm de diámetro a cubreobjetos de vidrio para evitar que flotaran, se esterilizaron con soluciones de etanol al 70 % v/v (EtOH, > 99,8 %, Honeywell) y luz ultravioleta, y se lavaron con PBS estéril para eliminar los rastros de EtOH, todo en un Gabinete de flujo laminar.

La biocompatibilidad celular y la diferenciación astrocítica en membranas PCL y PCL/GBN se llevaron a cabo con células de glioma de rata C6 (CCL-107™, ATCC®). Las células C6 se cultivaron en DMEM, enriquecido con 10% de FBS, 1% de aminoácidos no esenciales (NEAA) y 1% de penicilina/estreptomicina (P/S) a 37ºC en una atmósfera húmeda que contenía 5% de CO2. Todos los suplementos fueron adquiridos de Gibco™. El medio de cultivo se cambió cada 2 días hasta alcanzar el 80% de confluencia celular. Luego, se sembraron células C6 de manera uniforme (3,2 x 104 células por cm2) en membranas planas. Después de 24 h, se indujo la diferenciación astrocítica durante 5 días usando FBS al 0,5% en DMEM que contenía 1 mM de dibutiril-AMPc (dbcAMP, Sigma Aldrich). Los resultados se compararon con cubreobjetos de vidrio como control positivo.

Las células cultivadas en membranas planas se fijaron con paraformaldehído fresco al 3,7% en PBS durante 15 minutos, se permeabilizaron con Triton X-100 (0,5% en PBS) durante 5 minutos y se lavaron con PBS. A continuación, las muestras se incubaron durante 30 minutos en conjugado Phalloidin-FITC (Sigma Aldrich), se montaron en portaobjetos con medio antifade Vectashield (VectorLabs) conjugado con DAPI (4´,6-diamidino-2-fenilindol) y se examinaron en un LSM510. (Zeiss) microscopio de barrido láser que utiliza un objetivo de aceite (1,4 NA) de 40 × y 63 ×.

La diferenciación de células C6 se evaluó en membranas PCL y PCL/GBN realizando un análisis morfométrico del tamaño y la forma de las células en cada imagen confocal (n \(\ge\) 4) con el software ImageJ y mediante RT-qPCR y transferencia Western. técnicas. Tanto los resultados de RT-qPCR como de transferencia Western se compararon con cultivos celulares en TCP (Tissue Culture Plastics, control positivo).

Para los estudios de RT-qPCR, el ARN total se extrajo individualmente de las células de glioma C6 en cada grupo experimental mediante el reactivo Trizol (Invitrogen) y se purificó con el kit RNeasy (Qiagen). Las concentraciones de ARN total se determinaron utilizando un espectrofotómetro NanoDrop ND-1000 (Nanodrop Technologies, España). Se transcribieron de forma inversa 150 ng de ARN purificado a ADNc de primera cadena mediante un kit de transcripción inversa de ADNc de alta capacidad (Life Technologies) utilizando hexámeros aleatorios como cebadores. La expresión de los ARNm de Gfap y Glast se determinó mediante RT-qPCR utilizando cebadores basados ​​en SYBR Green específicos de genes (Invitrogen). Cada ensayo de RT-qPCR se realizó por triplicado. Se determinó el ciclo umbral (Ct) para cada pocillo y los resultados se normalizaron con Gapdh como referencia. La expresión genética relativa se calculó de acuerdo con la ecuación 2-(ΔΔCt). Las secuencias de ADN de los cebadores utilizados en este estudio fueron las siguientes: Gfap adelante 5'-CCAAACTGGCTGACGTTTACC-3', Gfap atrás 5'-TGGTTTCATCTTGGAGCTTCTG -3', Glast adelante 5'- GGCTGCGGGCATTCCTC-3', Glast atrás 5'-CGGAGACGATCCAAGAACCA-3', Gapdh adelante 5'- CATCAAGAAGGTGGTGAAGCAGG-3ʹ y Gapdh invierten 5ʹ-CCACCACCCTGTTGCTGTAGCCA-3ʹ.

Para la transferencia Western, las células C6 cultivadas durante 5 días se rasparon de las membranas PCL/GBN y TCP y se resuspendieron en 1 x tampón Laemmli (2% SDS, 0,1% 2-mercaptoetanol, 10% glicerol, 0,0005% azul de bromofenol y 63 mM). Tris-HCl pH 6,8) suplementado con cóctel inhibidor de proteasa completo. Las muestras se hirvieron durante 10 min a 100 °C y se aclararon mediante centrifugación a 11.000 rpm durante 5 min a 4 °C. Se sometieron cantidades iguales de proteínas a geles SDS-PAGE de poliacrilamida Nu-Page TG al 4–20% (Invitrogen) y se transfirieron a membranas de nitrocelulosa (tamaño de poro de 0,2 µm, Life Technologies). Luego, las membranas se enjuagaron dos veces con Tween-20 al 0,1% (PBS-T) y se bloquearon con leche en polvo desnatada al 5% (Biorad) en TBS/Tw. Finalmente, las membranas se incubaron con anticuerpos primarios anti-nestina policlonal de conejo (Sigma Aldrich, dilución 1:5000 en PBS-T) y anti-β-actina policlonal de cabra (Abcam, dilución 1:1000 en PBS-T) y se mantuvieron agitando. a 4 ºC durante la noche. Posteriormente, las membranas se incubaron durante 1 h con anticuerpos secundarios específicos anti-conejo y anti-cabra (Rockland Immunochemicals, dilución 1:5000 en PBS-T) a temperatura ambiente. Las bandas de proteínas se detectaron con un sistema de imágenes infrarrojas Odyssey™ (Li-Cor Biosciences, EE. UU.) y se cuantificaron utilizando el software ImageJ.

Todos los resultados se expresaron como media ± desviación estándar. Para todas las caracterizaciones, se realizó un análisis de varianza unidireccional (ANOVA) para determinar si había diferencias significativas entre las membranas PCL, tomadas como referencia, y las membranas PCL/GBN. El nivel de significación estadística se definió en p \(<\) 0,05.

Los conjuntos de datos de expresión génica de RT-PCR generados y analizados durante el estudio actual están disponibles en el repositorio de Zenodo (https://doi.org/10.5281/zenodo.6874249).

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Los autores desean agradecer a Aleksandra Pacuła (Instituto Jerzy Haber de Catálisis y Química de Superficies, Academia de Ciencias de Polonia) por las mediciones de AFM. MM-O reconoce la Beca FPU (19/02324) concedida por el Ministerio de Ciencia, Innovación y Universidades de España.

Esta investigación fue apoyada por los proyectos PID2019-105827RB-I00 y PCI2018-092929 (quinta convocatoria conjunta EIG-Concert Japan) financiada por MCIN/AEI/10.13039/5. “Instituto de Investigación Marqués de Valdecilla”, Santander, España (IDIVAL, programa de apoyo APG10). También contó con el apoyo parcial del Ministerio de Ciencia, Innovación y Universidades (MICINN), la Agencia Estatal de Investigación (AEI) y el Fondo Europeo de Desarrollo Regional (FEDER) Ciencia, Tecnología e Innovación (PCTI) 2018-2022 del Principado de Asturias y FEDER a través del proyecto IDI/2021/0

Departamento de Ingenierias Química y Biomolecular, Universidad de Cantabria, Avda. Los Castros s/n, 39005, Santander, Spain

Marian Mantecon-Oria, María J. Rivero, Nazely Diban & Ane Urtiaga

Instituto Marqués de Valdecilla (IDIVAL), 39011, Santander, Spain

Marian Mantecon-Oria, Miguel Lafarga, Maria T. Berciano, Nazely Diban & Ane Urtiaga

Research Group on Food, Nutritional Biochemistry and Health, Universidad Europea del Atlántico, 39011, Santander, Spain

Olga Tapia

Centro de Investigación Biomédica en Red Sobre Enfermedades Neurodegenerativas (CIBERNED), 28029, Madrid, Spain

Olga Tapia, Michael Lafarga & María T. Berciano

Departamento de Anatomía y Biología Celular, Universidad de Cantabria, 39011, Santander, Spain

Miguel Lafarga

Departamento de Biología Molecular, Universidad de Cantabria, 39011, Santander, Spain

María T. Berciano

Instituto de Ciencia y Tecnología del Carbono, INCAR-CSIC, C/Francisco Pintado Fe 26, 33011, Oviedo, Spain

Jose M. Munuera, Silvia Villar-Rodil & Juan I. Paredes

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MM-O.: redacción, recogida de datos, metodología, tratamiento de datos. OT: metodología, supervisión, revisión de redacción. ML: redacción, revisión y edición. MTB: revisión y edición de escritura. JMM: metodología, revisión de redacción. SV: metodología, recolección de datos. JIP: supervisión, revisión de redacción y edición. MJR: diseño metodológico, supervisión, revisión de redacción y edición. ND: concepción y diseño metodológico, supervisión, revisión de redacción y edición. AU: diseño de metodología, revisión de redacción y edición.

Correspondencia a Nazely Diban.

Los autores declaran no tener conflictos de intereses.

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Reimpresiones y permisos

Mantecón-Oria, M., Tapia, O., Lafarga, M. et al. Influencia de las propiedades de diferentes nanomateriales basados ​​en grafeno dispersos en membranas de policaprolactona en la diferenciación astrocítica. Informe científico 12, 13408 (2022). https://doi.org/10.1038/s41598-022-17697-9

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Recibido: 16 de mayo de 2022

Aceptado: 29 de julio de 2022

Publicado: 04 de agosto de 2022

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-022-17697-9

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